3T3-L1细胞分导诱化（微生物实验室气溶胶污染预防与控制）
研究表明已知原因的实验室感染只占全部感染的18%，不明原因的实验室感染却高达82%。对不明原因的实验室感染的研究表明，医学实验室的许多操作可以产生气溶胶，由于其气溶胶分子小，易漂浮在空气中，大多数可能是病原微生物形成的感染性气溶胶在空气扩散而污染实验室的空气，当工作人员吸入了污染的空气，便可以引起实验室相关感染。在病原微生物实验室中，产生的微生物气溶胶可分为两大类：一类是飞沫核气溶胶，另一类是粉尘气溶胶。
这两类微生物气溶胶对实验室工作人员都具有严重的危害性，其程度取决于微生物本身的毒力、气溶胶的浓度、气溶胶粒子大小以及当时实验室内的微小气候条件。一般来说，微生物气溶胶颗粒越多，粒径越小，实验室的环境越适合微生物生存，引起实验室感染的可能性就越大。
在离心、烧接种环、剧烈震荡或混匀时极易形成带菌的气溶胶。因此样本的离心工作必须在开放实验室内进行，真空采血管须在生物安全柜中打开或在离心机中静置30min后才能打开。细菌室酒精灯火焰上应套一个长管，使酒精灯火焰上方有充足的无菌空间，最好使用焚烧灯。
任何有可能产生细颗粒气溶胶的操作步骤(如标本编号、血清分离、细菌接种等)标本处理原则上在有合格证的生物安全柜内进行。对于暂无生物安全柜的实验室，可在超净台内处理标本，但切不可开启排风装置，以减少病毒在空气中弥散。处理标本使用专用离心机，离心时应使用密闭的离心机转头或密闭样品杯。理想情况下，应在生物安全柜内取出离心机转头或样品杯。离心机使用完毕，立即用含有效氯1500mg/L消毒液进行表面消毒。因此做好医学实验微生物气溶胶的净化工作，有助于降低院内感染的发生，保护在场所工作的人员的安全。
一、微生物气溶胶的定义
是指液体或固体微粒均匀地分散在气体中形成的相对稳定的悬浮体系。
微生物气溶胶是一群形体微小，构造简单的单细胞或接近单细胞的生物悬浮于空气中所成的胶体体系。粒子大小在0.01～100μμm，一般为0.1～30μm。
二、微生物气溶胶的特点
1、生物气溶胶无色无味、无孔不入，不易发现，实验人员在自然呼吸中不知不觉吸入而造成感染。若治疗控制不及时会造成严重后果。
2、与其自然感染的疾病相比，有些微生物气溶胶感染的症状不典型，病程复杂，难以及时诊治，影响预后。
3、有些气溶胶感染只有呼吸道粘膜免疫才有预防作用，非呼吸道免疫途径预防作用效果欠佳。现有常规疫苗的预防效果不理想，如肺炭疽。
4、呼吸道传播的传染病的微生物特别是高致病性病毒常常发生变异，尤其是其抗原性、致病性都可能发生改变，在空气中存活力增强。
5、气溶胶传播容易发生病原体在人与人、人与动物、动物与动物之间的传播。
6、可以远距离或较远距离传播，这是其与其他传播途径的显著区别，也是气溶胶传播难以预防的另一重要原因。
医学实验室气溶胶污染净化的国家标准要求：
(1) 低温高速离心机或其他可能产生气溶胶的设备应置于负压罩或其他排风装置(通风橱、排气罩等)之中，应将其可能产生的气溶胶经高效过滤后排出。
(2) 污染区内应设置不排蒸汽的高压蒸汽灭菌器或其他消毒装置。
安全防护防止气溶胶的扩散与吸入
防止气溶胶的扩散
无论是哪一种微生物实验室，只要操作感染性物质，气溶胶的产生是不可避免的。因此，除了控制空气传播感染的第一环节，还要防止气溶胶扩散，这是控制空气传播感染的第二环节。在实验室中，有多种措施可以有效防止气溶胶的扩散，例如“围场操作”、“屏障隔开”、“有效拦截”、“定向气流”、“空气消毒”等，这些防护措施的综合利用可以获得良好的效果。
1、围场操作：围场操作是把感染性物质局限在一个尽可能小的空间(例如生物安全柜)内进行操作，使之不与人体直接接触，并与开放之空气隔离，避免人的暴露。实验室也是围场，是第二道防线，可起到“双重保护”作用。围场大小要适宜，以达到既保证安全又经济合理的目的。目前，进行围场操作的设施设备往往组合应用了机械、气幕、负压等多种防护原理。
2、屏障隔离：气溶胶一旦产生并突破围场，要靠各种屏障防止其扩散，因此也可以视为第二层围场。例如，生物安全实验室围护结构及其缓冲室或通道，能防止气溶胶进一步扩散，保护环境和公众健康。按国家标准《实验室生物安全通用要求》的要求，进出核心实验室的缓冲间是必需的设置。这是因为：
(1) 避免污染扩散，尽可能把污染限制在最小的范围内;
(2) 一旦室内出现正压，工作人员可在缓冲室内换气、净化空气、安全撤离;
(3) 退出实验室时可在其内换鞋、脱去外层衣服和手套、必要的消毒，避免内层衣服污染或污染其他房间。
3、定向气流：对生物安全三级以上实验室的要求是保持定向气流。其要求包括：
(1) 实验室周围的空气应向实验室内流动?以杜绝污染空气向外扩散的可能，保证不危及公众;
(2) 在实验室内部，清洁区的空气应向操作区流动，保证没有逆流，以减少工作人员暴露的机会;
(3) 轻污染区的空气应向污染严重的区域流动。
以BSL-3实验室为例，原则上半污染区与外界气压相比应为一20Pa，核心实验室气压与半污染区相比也应为一20Pa，感染动物房和解剖室的气压应低于普通BSL-3实验室核心区。
4、有效消毒灭菌：实验室生物安全的各个环节都少不了消毒技术的应用，实验室的消毒主要包括空气、表面、仪器、废物、废水等的消毒灭菌。在应用中应注意根据生物因子的特性和消毒对象进行有针对性的选择。并应注意环境条件对消毒效果的影响。凡此种种，都应在操作规程中有详细规定。
5、有效拦截：是指生物安全实验室内的空气在排人大气之前，必须通过高效粒子空气(HEPA)过滤器过滤，将其中感染性颗粒阻拦在滤材上。这种方法简单、有效、经济实用。HEPA滤器的滤材是多层、网格交错排列的，因此其拦截感染性气溶胶颗粒的原理在于：
(1) 过筛：直径小于滤材网眼的颗粒可能通过，大于的被拦截;
(2) 沉降：对于直径0.3/zm以上的气溶胶粒子作用较强。气溶胶粒子直径虽然小于网眼，由于粒子的重力和热沉降或静电沉降作用也可能被阻拦在滤材上;
(3) 惯性撞击：气溶胶粒子直径虽然小于网眼，由于粒子的惯性撞击作用也可能阻拦在滤材上;
(4) 粒子扩散：对于直径小于o.1Um的气溶胶粒子作用较强，气溶胶粒子虽然小于网眼，由于粒子的扩散作用也可能被阻拦在滤材上。
依照上述原理，最不容易滤除的粒子是0.1～0.3um的粒子。
防止气溶胶的吸入
尽管采取了上述防止气溶胶扩散的种种措施，但由于气溶胶具有很强的扩散能力，还是不可避免地污染实验室的空气。所以，实验室工作人员仍然需要进行个人防护，以防止气溶胶吸人。
气溶胶的传染
今后在室内生物气溶胶重点应放在应用基础上，主要有：
1、室内生物气溶胶的来源和危害性;
2、室内生物气溶胶污染与疾病的关系;
3、影响室内生物气溶胶的环境因素;
4、室内微生物环境下生物气溶胶的有益应用;
5、控制室内生物气溶胶的技术;
6、研究生物气溶胶检测仪和大流量空气微生物采样器;
7、规范室内生物气溶胶研究方法和程序
通过以上7个方面的研究，可以从根本上预防和控制室内生物污染，改善空气质量，包括工作环境的空气质量的居住环境的空气质量，从而达到预防疾病的目的。
首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一(IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶，Ins用的人用胰岛素)，最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.
让细胞长满以后，接触抑制2天(是细胞退出生长周期)，加入含有IBMX(一般使用浓度0.5mmol/L)，DEX(地塞米松，一般使用浓度是 1umol/L)和insulin(胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml)的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液(普通培基)。这 是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，细胞传代次数较多，分化率很低。一般说不能超过20代，最好在10代以内。诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。
诱导剂的配制
IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2(Sigma:I5879)-20度保存
用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml(0.5mol/L)储存液
终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。
DEX： 分子量：392.5(Sigma:D4902)-20度保存
用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液
终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。可用2年。
Insulin：分子量：6000 ,4度保存
原液为诺和灵R：400IU/10ml
终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。4度保存
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化
将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5%CO2培养;
待细胞长满至80-90%，融合2天(融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天)后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX(储存液浓度0.5mmol/L)、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h;(诱导剂临用时再加到培液中混匀)
48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
诱导操作注意事项：
1、 一共需诱导3次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h，若时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h。
2、 诱导操作需注意：以6孔板为例，每孔3ml培液，一个6孔板需18ml培液，则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul(储存液)，DEX7.2ul储存液，胰岛素108ul(储存液)。第一遍诱导时用200ul的移液枪先每孔加200ul配制好的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细胞会飘起来，俗称卷边。每孔加5遍200ul培液，合计1ml，第二、三遍则每孔1000ul加培液，方法同上，操作要慢、轻。
3、 第2次诱导时，诱导剂的配制为：18ml培液，加胰岛素108ul(储存液)，混匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第3次诱导诱导仅需换10%高糖DMEM培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培液看起来就黄了。
4、 第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次1ml的培液换，一般换液2天后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。
细胞是否诱导成功细胞代数很重要，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。
3T3-L1细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导(MDI诱 导，DMEM高糖+胎牛血清)，第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导(insulin诱导，DMEM高糖+胎牛血清)，细胞中 就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定浓度的KOH溶解的，insulin是在一定浓度的HCL中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为3T3-L1细胞，但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入分化诱导的时候，一定不能用胎牛血清来养细胞，在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的1两天进行一次换液，因此一定要小心被污染!
因为3T3-L1加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管家的时候很难控制流速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的话，还是能用，没有什么大的影响，如果范围比较大的话最好重新诱导。你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX大家一般都是用 0.5mmol/L，胰岛素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。
一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1长得非常快，如果长满以后不换液，会有大批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在10*4数量级，这样让细胞长3天后铺满，再换液，再让细胞长 2-3天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest状态。2，IBMX的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH溶液都可，针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的insulin，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化。
