细胞培养标准操作程序（THP-1 细胞培养）

　　THP-1是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者。属于悬浮细胞，适合用于转染或感染实验。其表面抗原HLA型为：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。

　　工具/原料

　　· 培养基：RPMI-1640 (Invitrogen #11875-093)

　　· 胎牛血清：Fetal Bovine Serum (FBS, GIBCO #10099-141)

　　· 二甲亚砜：DMSO (SIGMA D2650)

　　· 双抗P/S (Penicillin/Streptomycin)(GIBCO #15140-122)

　　方法/步骤

　　细胞培养：THP-1细胞培养于含有10%FBS+1%P/S的RPMI-1640培养基中，培养环境为37℃，5%CO2。可以每隔3-4天加一些新鲜的培养基，或直接传代。

　　细胞传代：当细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时，即可进行传代。由于是悬浮细胞，可直接将细胞吸出，离心之后传代。传代最少浓度不应少于1x10^5 cells/ml。

　　细胞冻存：取差不多1x10^7个细胞，用1ml含有10%DMSO的FBS重悬，转入冻存管，于-80℃冰箱过夜。第二天移入液氮中长期保存。

　　注意事项

　　· 细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。

　　· 细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC(American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心)生命力要强于国内细胞库的。

　　· 注意细胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数会增加。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

　　· THP-1细胞适合在细胞Ph环境偏酸性环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同Ph的1640。

　　· 传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增;1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好;2)不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次(只是补充培养基)3) 使用1640(ATCC推荐)，注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱; 4)注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存。

　　· 复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的。

　　1.目的：

　　为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

　　2.适用范围：

　　适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

　　3.操作规程：

　　3.1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制

　　3.1.1 1000ml培养液的配制

　　1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。

　　2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解，并冲洗袋内残留粉末。

　　3、充分搅拌，按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等)，再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

　　4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7.0左右(细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右)。

　　5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。

　　6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解

　　配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解

　　取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。

　　7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。

　　注意：

　　(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。

　　一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

　　(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌!烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗

　　水)的容器均不需高压灭菌，干净即可。

　　3.1.2 PBS(平衡盐溶液)的配制

　　NaCl 8g

　　KCl 0.2g +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ml

　　Na2HPO4*H2O 1.56g

　　KH2PO4 0.2g

　　(1) 无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌(高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!)

　　(2) Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g

　　(3) 如欲配制500ml，以上成分减半即可

　　3.1.3 0.25%胰蛋白酶的配制

　　胰蛋白酶粉 2.5g

　　EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 0.3g

　　NaCl 8.0g

　　KCl 0.4g ` +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ML

　　NaHCO3 0.5g

　　Glucose(葡萄糖) 1.0g

　　酚红 0.06g

　　(1)配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。

　　(2)用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。

　　(3)用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌!而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌，干净即可。

　　(4)如欲配制500ml，以上成分减半即可

　　3.2 细胞复苏

　　1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸;培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。

　　2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中(一滴约为50ul)。

　　3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。(慢冻快融)

　　4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min(用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大)，弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS浓度为20%)。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。

　　5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。(注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。)

　　6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

　　注意：

　　(1)入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa!

　　(2)刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20%。

　　(3)离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。

　　(4)滴管使用注意事项：

　　a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。

　　b.培养基和FBS(胎牛血清)可以用一个滴管，但分开用更好!

　　c. FBS(胎牛血清)不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。

　　d.胰酶和PBS(平衡盐溶液)可以用一根滴管，不过最好分开

　　(5)不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长(如2年以上)，技术不过关(如吹打太激烈)、细胞传代数太多等。

　　(6)关于PBS(平衡盐溶液):

　　a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用;PBS高压时其瓶塞一定要插针头。

　　b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。

　　c.不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。

　　d.消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3ml PBS(防止培养瓶干燥)，培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。

　　(7)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清)，防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性!

　　3.3 细胞换液

　　1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：

　　a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞;

　　b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清;能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。

　　c.生长状态不良的细胞: 细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。

　　d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。

　　2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS(胎牛血清)可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS(胎牛血清)的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。

　　3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处(注意不要把胶盖烧焦)，滴管(前端90%部位)灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染;滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗(要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗)!

　　4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶(25c㎡)中，再用吸FBS(胎牛血清)的滴管吸取FBS 10滴加入到培养瓶中。(使FBS浓度为10%)

　　5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。

　　6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

　　注意:

　　(1)在打开培养基、FBS(胎牛血清)、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。

　　(2)镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上;取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。

　　(3)滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧!滴管千万不能混用!

　　(4)培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。

　　(5)培养液以没过细胞为宜。

　　(6)细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。

　　3.4 细胞计数

　　1、原理：

　　(1)计算细胞数目用血球计数盘计数。

　　(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

　　细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×104

　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

　　2、计数方法：

　　(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。

　　(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘(注意不要溢出，不要有气泡)。

　　(3) 观察计数：压线的记左不记右，记上不记下;成团的细胞只记为1个;先用低倍镜(红色，4×)找出大位置，再用中倍镜(黄色，10×)进行计数。

　　细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×104

　　(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布(或干棉签)擦一遍。

　　3.5 细胞传代

　　1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。

　　2、取灭菌试管1支，配完全培养基(含10%FBS)3ml(培养基:FBS=54滴：6滴)。

　　3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。

　　4、胰酶消化：加入约1ml(20滴)胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化，(在37℃胰酶消化效果最佳)。

　　5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。

　　6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略(可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。

　　7、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数!)

　　8、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml(60滴)细胞悬液，取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基(培养基:FBS=9:1)使液体总体积达到4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。

　　9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

　　注意：

　　(1)对于难消化的细胞(如Bxpc-3胰腺癌细胞)在用胰酶消化前，先用1～2ml(即20～40滴，或1～2滴管)4 ℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。

　　(2)一定要防止细胞过消化!因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。

　　* 过消化特征：

　　a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。

　　b.培养瓶底板上本身为白茫茫(细胞贴壁生长)，而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一片片空隙。

　　(3)过消化的处理：不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中，经过800 rpm 离心3min，弃去上清(失活的胰酶、培养基、FBS)。细胞沉淀(白色沉淀物)在试管底，用手指轻弹打散细胞，重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养。

　　(4)在加入未经37℃温育的胰酶(指仅为室温)消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来。那是因为胰酶的温度不适宜;而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度(37℃)下消化细胞。

　　(5)把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不均，影响在培养瓶中生长。

　　(6)用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生。

　　(7)吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。

　　(8)完全培养基为含有10%FBS(胎牛血清)的培养液(基)。

　　(9)小牛血清使用范围：5～20%，10%最常用。血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，则血清用20%。

　　(10)一般25c㎡培养瓶需培养液5ml，通常需90滴培养基+10滴胎牛血清(FBS)，一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。

　　(11)一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。

　　3.6 细胞铺板(如12孔板)

　　1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。

　　2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml(培养基:FBS=54滴：6滴)

　　3、消化同前，注意防止过消化。吹打混匀计数，如为：8.0×10 5个/ml

　　4、稀释细胞悬液：根据经验，细胞密度0.8×10 5个/ml较合理，因每孔需加培养液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml(因试管体积有限，6ml即120滴)，则配制细胞悬液： 8.0×10 5个/ml ×x ml = 0.8×10 5个/ml × 6ml，x=0.6ml

　　即 细胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴

　　完全培养基： 6ml-0.6ml=5.4ml (5.4×20滴=108滴)

　　97滴培养基+ 11滴FBS

　　故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。

　　5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按顺序依次滴入。注意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀!

　　6、继续稀释细胞悬液6ml，操作同前。

　　7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置5min后，在显微镜下观察细胞是否铺均匀，如不均匀，将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液1ml，采用700ul枪吹打(不能用滴管，会刮花底面)，可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。

　　注意：小心吹打，最好不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观察。吹打后放倒置显微镜下观察，若不够均匀，继续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染。

　　8、吹打完毕后，小心将细胞板放CO2培养箱培养。(注意：拿细胞板避免晃动，最好直拿直放，不要推动移动，否则细胞容易成团。)

　　9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。

　　注意：(1)若铺96孔板，则需在96孔板周围一圈孔中加入PBS，防止干燥。

　　(2)各种不同规格板的铺板细胞数量：

　　3.7 细胞冻存

　　1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase)且存活率高之状态，约为80–90%致密度。

　　2、依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞于试管中，取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度，一般冻存细胞浓度约1～5×106 cells/ml，依细胞种类而异。

　　3、用试管塞塞住试管，配平，800 rpm 离心3min，去除上清液，加入适量完全培养液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀。

　　4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中，再加入2滴FBS，2滴DMSO(二甲基亚砜，为细胞冻存保护剂)，使FBS浓度为20%，DMSO浓度为10%。盖紧冻存管盖，在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。

　　5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时(勿超过1周)，然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。

　　注意：

　　(1) 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。

　　(2)冷冻保存之细胞浓度：

　　①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

　　②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

　　③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml

　　④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

　　(3)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

　　(4)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，且能以较快的速度渗透到细胞内，故冻存细胞时使用室温下的DMSO，在冻存的细胞复温后，应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清)，防止DMSO对细胞产生毒性。